A engenharia genética
A engenharia genética consiste num conjunto de técnicas
laboratoriais que permitem manipular o material genético de um
organismo, alterando as suas características de forma precisa e
controlada.
Lista de técnicas:
1. Enzimas de restrição
2. ADN recombinante (rADN)
3. ADN complementar (cADN)
4. Eletroforese em gel
5. PCR
6. Sequenciação de ADN
7. Edição genética (CRISPR-Cas9)
8. Edição genética e bioética
1. Enzimas de restrição
• são proteínas que reconhecem sequências
específicas de ADN (sítios de restrição) Cada
enzima de restrição reconhece apenas um ou
alguns sítios de restrição)
• São encontradas em bactérias (as enzimas
de restrição surgiram provavelmente como um
mecanismo de defesa, permitindo que as
bactérias cortem o ADN estranho por exemplo, o
ADN dos vírus infetantes de bactérias)
• realizam um corte preciso no ADN,
funcionando como tesouras moleculares.
Quando a enzima encontra a sequência alvo, a
enzima de restrição faz um corte na dupla hélice
da molécula de ADN. Normalmente, o corte é no
sítio de restrição ou próximo a ele.
• origina extremidades coesivas (“pegajosas”,
sticky ends”), o que determina a forma como
os fragmentos podem ser ligados
posteriormente. Podem também originar um
corte perpendicular.
1. Enzimas de restrição
• Os fragmentos com corte perpendicular, sem
terminações de fita única, podem ser unidos um ao
outro pela DNA ligase. No entanto, fragmentos deste
tipo são mais difíceis de se ligarem (a reação de ligação
é menos eficiente e mais propensa a falhar) porque não
há terminações de fita única para manter as moléculas
de DNA na posição.
• são nomeadas a partir das espécies de procariontes dos
quais foram isoladas. Por exemplo, as enzimas isoladas
da bactéria Escherichia coli começariam com Eco (como
em EcoRI). (já foram isoladas mais de 3000 enzimas de
restrição)
sequência palindrómica é uma sequência
de nucleótidos em que a leitura é a mesma
nos dois sentidos
1. Enzimas de restrição
• Na replicação de DNA (estudada no 11.o ano), o trabalho das
DNA ligases é unir fragmentos de DNA recém sintetizados
(okasaki). As ligases usadas na engenharia genética e fazem
basicamente a mesma coisa. Se dois segmentos de DNA tiverem
terminações complementares, a DNA ligase pode juntá-los .
• São usadas para isolar genes de interesse, abrir plasmídeos e
preparar o ADN para clonagem ou recombinação, sendo uma
etapa fundamental em qualquer processo de engenharia
genética.
Os plasmídeos são pequenas moléculas de ADN
circular, independentes do cromossoma bacteriano,
que se encontram naturalmente em muitas bactérias.
Têm genes próprios (por exemplo, resistência a
antibióticos) e replicam-se autonomamente dentro da
célula.
Na engenharia genética, os plasmídeos são usados
como vetores, isto é, como “transportadores” de um
gene de interesse que é inserido no plasmídeo e depois
introduzido na bactéria. A célula passa então a
multiplicar esse gene e, em muitos casos, a produzir
a proteína correspondente (como a insulina humana)
1. Enzimas de restrição
Exemplo: construção de um plasmídeo recombinante
Suponha que temos um gene alvo, ladeado com sítios de
reconhecimento da EcoRI, e um plasmídeo, contendo um único sítio EcoRI:
1. usamos a enzima EcoRI para inserir o gene no plasmídeo.
2. cortamos o fragmento do gene e o plasmídeo com EcoRI. Este passo produz
fragmentos com extremidades adesivas.
3. Em seguida, o fragmento de gene e o plasmídeo linearizado (aberto) são
combinamos com a DNA ligase. As extremidades adesivas dos dois fragmentos
unem-se por pareamento de bases complementares.
4. os fragmentos se tornam um único pedaço de DNA intacto. O gene alvo agora
está inserido no plasmídeo, fazendo um plasmídeo recombinante.
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Tecnologia do DNA recombinante para a produção de insulina humana.
3. O ADN complementar (cADN)
• é sintetizado a partir de ARN mensageiro (ARNm)
pela ação da transcriptase reversa.
• Como o ARNm resulta do processamento do RNA, o
cADN contém apenas os exões (genes expressos), sem
intrões, o que facilita a sua clonagem em bactérias e a
produção de proteínas.
• Esta técnica é essencial em estudos de expressão
génica, na construção de bibliotecas de cADN e em
aplicações biotecnológicas.
4. Eletroforese em gel
• é uma técnica usada para separar
fragmentos de DNA de acordo com seu
tamanho (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) .
• As amostras de DNA são carregadas nos
poços (cavidades) localizados numa das
extremidades de um gel, e uma corrente
elétrica é aplicada para fazê-las avançar
pelo gel.
• Os fragmentos DNA estão carregados
negativamente, então movem-se na direção do
eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos
de DNA têm a mesma quantidade de carga por
massa, os fragmentos menores atravessam
o gel mais rapidamente do que os
maiores.
• Quando um gel é pigmentado com um corante
que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA
podem ser vistos como bandas, cada uma
representando um grupo de fragmentos de
DNA de mesmo tamanho.
4. Eletroforese em gel
4. Eletroforese em gel
Visualização dos fragmentos de DNA
Depois que os fragmentos tenham sido
separados e o pigmento do gel ter-se ligado ao
DNA, este é colocado sob luz UV; os
fragmentos de DNA brilham, o que nos permite
visualizar o DNA presente em diferentes locais
ao longo da extensão do gel.
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é
chamada de banda. Cada banda contém um
grande número de fragmentos de DNA do
mesmo tamanho e todos os que viajaram,
como um grupo, para a mesma posição.
Ao comparar as bandas de uma amostra em
relação à escada de DNA, podemos determinar
os tamanhos aproximados. Por exemplo, a
banda brilhante no gel acima tem,
aproximadamente, o tamanho de 700 pares
de bases (bp).
O bp ao lado de cada número na escada indica
quantos pares de base tem no comprimento do
fragmento de DNA.
4. Eletroforese em gel
• Exemplo:
Quatro faixas são numeradas no gel ao lado.
A faixa é um corredor através do qual o DNA passa
assim que sai de um poço.)
Qual faixa corresponde a cada descrição?
a) Esta faixa contém o fragmento de DNA mais longo.
b) Esta faixa contém o fragmento de DNA mais curto.
c) Esta faixa contém um fragmento de DNA de 1500
pares de base (bp).
5. reação em cadeia da polimerase (PCR)
• técnica rotineira de laboratório usada para
fazer milhões de cópias de uma região
específica do DNA. Essa região do DNA
pode ser qualquer objeto de interesse do
pesquisador. Por exemplo um gene ou um
marcador genético usado pelos cientistas
forenses para correlacionar o DNA da cena
do crime com os suspeitos.
• A PCR depende de uma DNA polimerase
termoestável, a Taq polimerase,
e requer primers de DNA projetados
especificamente para a região de interesse
do DNA .
• Na PCR, a reação é repetida
ciclicamente através de uma série de
alterações de temperatura, o que
possibilita a produção de muitas cópias
da região de interesse.
Termociclador PCR -Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente
ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).
5. Reação em cadeia de Polimerases (PCR)
As etapas (resumidamente):
1.Desnaturação (96°C): Aquece a reação para separar as fitas de DNA.
2.Anelamento (55-65°C): Arrefece a reação para que os primers
possam ligar-se às suas sequências complementares no DNA molde de
fita simples.
3.Extensão (72°C): Eleva a temperatura da reação para que
a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA
5. Reação em cadeia de Polimerases (PCR)
5.1 A PCR nas ciências forenses
• Suponha que trabalha num laboratório forense.
Acabou de receber uma amostra de DNA de um
cabelo deixado numa cena de crime, juntamente
com amostras de DNA de três possíveis suspeitos.
Tem a tarefa de examinar um marcador genético
em particular e verificar se algum dos três
suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse
marcador.
• O marcador vem em dois alelos. Um deles contém
uma única repetição (região castanha ao lado),
enquanto o outro contém duas cópias da repetição.
Numa reação PCR com primers que atuam na
região de repetição, o primeiro alelo produz um
fragmento de DNA de 200 bp, enquanto o
segundo produz um fragmento de DNA de 300 bp.
• Depois de realizar PCR nas quatro amostras de
DNA e visualiza os resultados por eletroforese
em gel, como representado ao lado:
5.1. A PCR nas ciências forenses
O DNA de qual suspeito coincide com o DNA da cena do
crime para o marcador?
A) Suspeito 1
B) Suspeito 2
C) Suspeito 3
D) Nenhum dos suspeitos
5.1. A PCR nas ciências forenses
(Humanos são diploides, assim haverá duas cópias do
marcador que estamos avaliando em cada uma das
amostras de DNA).
Se uma pessoa tem dois diferentes alelos do marcador
(é heterozigótico), duas bandas de diferentes tamanhos
(200 pb e 300 pb serão amplificadas durante a PCR.
Aparecerão como bandas de DNA dentro do gel nas
localizações para 200 pb e 300 pb.
O DNA de qual suspeito coincide com o DNA da cena do
crime para o marcador?
A) Suspeito 1
B) Suspeito 2
C) Suspeito 3
D) Nenhum dos suspeitos
•DNA da cena do crime: alelo homozigótico de 200 pb
•Suspeito 1: alelo homozigoto de 300 pb
•Suspeito 2: heterozigótico
•Suspeito 3: alelo homozigótico de 200 pb
6. Sequenciação de ADN
• A sequenciação de ADN determina a
ordem exata dos nucleótidos (A, T, C,
G) numa molécula de ADN.
• Permite identificar genes, detetar
mutações, comparar genomas e estudar
relações evolutivas.
• É essencial no diagnóstico de doenças
genéticas, na medicina personalizada
e na investigação científica, tendo sido
uma técnica central em projetos como o
Projeto Genoma Humano
7. Edição genética (CRISPR-Cas9)
• A edição genética (CRISPR-Cas9) é uma
tecno...
